在探索疫苗研究前沿：細(xì)胞免疫原性的應(yīng)用與挑戰(zhàn)（上）一文中，我們已經(jīng)對細(xì)胞免疫原性在新冠疫苗、VZV疫苗、腫瘤治療性疫苗，以及新佐劑研究中的應(yīng)用進(jìn)行了介紹。承接前文，本文將繼續(xù)針對細(xì)胞免疫在疫苗臨床研究中的應(yīng)用和難點(diǎn)進(jìn)行探討。

PART 01

《預(yù)防用疫苗臨床可比性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》（2019年），以體液免疫為主的疫苗，其免疫原性替代終點(diǎn)通常采用接種后免疫應(yīng)答率（包括抗體陽轉(zhuǎn)率等）和抗體幾何平均滴度（GMT）/幾何平均濃度（GMC）及其增長倍數(shù)。鑒于免疫學(xué)理論及檢測方法的進(jìn)展迅速，鼓勵同時開展細(xì)胞免疫學(xué)指標(biāo)的探索，更全面地反映疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

《新型冠狀病毒預(yù)防用疫苗臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》（試行，2020年），對于細(xì)胞免疫功能評價，建議檢測抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)及相關(guān)的細(xì)胞因子等。建議考慮的檢測指標(biāo)：特異性T細(xì)胞：CD4+、CD8+、Th1、Th2、Th17、Treg細(xì)胞亞群；CD3+T細(xì)胞、CD20+B細(xì)胞和CD16+NK細(xì)胞的比例。細(xì)胞因子：IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-γ、TNF-α水平。若細(xì)胞免疫對于評價疫苗（如病毒載體疫苗、核酸疫苗）的免疫原性具有重要意義，則細(xì)胞免疫應(yīng)作為必需的免疫原性研究內(nèi)容。病毒載體疫苗、核酸疫苗建議進(jìn)行細(xì)胞免疫的持久性觀察。

《新型冠狀病毒預(yù)防用mRNA疫苗藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》（試行，2020年），生物學(xué)活性檢測應(yīng)體現(xiàn)疫苗體液免疫和細(xì)胞免疫，體內(nèi)效力試驗(yàn)需根據(jù)mRNA疫苗理論的免疫反應(yīng)原理應(yīng)評價其體液免疫和/或細(xì)胞免疫的生物活性。建議建立檢測評價細(xì)胞免疫的方法（如利用細(xì)胞因子ELISPOT檢測評價特異性CTL反應(yīng)等方法）進(jìn)行細(xì)胞免疫效價的評價。

《腫瘤治療性疫苗臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》（征求意見稿，2022）：對于多種抗原組分的腫瘤治療性疫苗來說，抗腫瘤免疫反應(yīng)可能涉及多種組分，需要多種檢測分析來識別和檢測免疫反應(yīng)的不同組分。常見的檢測方法有中和抗體檢測、細(xì)胞因子檢測、四聚體檢測、ELISPOT檢測等。針對誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答類型（體液免疫或細(xì)胞免疫）選擇合適的檢測方法，建議使用至少兩種免疫學(xué)檢測方法來評估抗腫瘤免疫反應(yīng)。且建立的檢測方法應(yīng)經(jīng)過驗(yàn)證，以確保方法的有效性和數(shù)據(jù)的可靠性。

PART 02

細(xì)胞因子的產(chǎn)生在免疫反應(yīng)中起重要作用。細(xì)胞因子參與許多不同的途徑，包括 IFN γ 誘導(dǎo)許多抗病毒蛋白、IL-2 誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖以及 TNF α 抑制病毒基因表達(dá)和復(fù)制，此外，細(xì)胞因子不是預(yù)先形成的因子，而是響應(yīng)細(xì)胞活化而迅速產(chǎn)生和分泌。

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（enzyme linked immunospot assay， ELISPOT）和基于流式細(xì)胞術(shù)的胞內(nèi)細(xì)胞因子染色（intracellular cytokine staining，ICS）是評價疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答最常用的兩種檢測方法。

表1  疫苗細(xì)胞免疫檢測方法：ELISPOT和ICS

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）是細(xì)胞免疫研究中最為靈敏的檢測方法，可以在單細(xì)胞水平對抗體分泌細(xì)胞(如B細(xì)胞)及細(xì)胞因子分泌細(xì)胞（如T細(xì)胞）進(jìn)行檢測，該方法有極高的靈敏度，可達(dá)20-25斑點(diǎn)/100萬細(xì)胞，并且該方法能夠?qū)乖碳ず蟮幕罴?xì)胞進(jìn)行功能性檢測，是疫苗領(lǐng)域藥效評估的關(guān)鍵檢測方法。此外，ELISPOT技術(shù)在基因治療，細(xì)胞治療，抗體/雙特異抗體藥物等臨床生物分析領(lǐng)域得到越來越多的應(yīng)用。

胞內(nèi)細(xì)胞因子染色（ICS）是一種基于流式細(xì)胞術(shù)的檢測方法，可檢測免疫細(xì)胞受到刺激后細(xì)胞因子的產(chǎn)生和積累。ICS既可以對細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，也可以使用細(xì)胞表面標(biāo)志物或MHC多聚體進(jìn)行免疫表型分析，以檢測抗原特異性反應(yīng)免疫細(xì)胞亞群，使其成為一種極其靈活和通用的方法。

PART 03

用于細(xì)胞免疫評估的樣品為PBMC，在非臨床研究中，考慮到采血量的限制通常取實(shí)驗(yàn)動物的脾臟和淋巴結(jié)組織后直接進(jìn)行PBMC的分離，而在臨床研究中，需要采集外周血后進(jìn)行PBMC的分離。

PBMC的活性和功能對細(xì)胞免疫原性檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，臨床中心采集外周血后到分離PBMC的時長、提取方式、凍存方式、運(yùn)輸條件、解凍和復(fù)蘇步驟等環(huán)節(jié)均可能會影響到PBMC的活性，并進(jìn)一步影響后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果的評估。因此，細(xì)胞免疫原性檢測前需要規(guī)范化PBMC的處理方式，在保留較大提取收率的同時，也要有效維持PBMC的活性和功能。

圖1  全血放置24h和48h會顯著影響PBMC活性以及特異性的細(xì)胞因子分泌 ^[20]

通常情況下需要在全血采集后的8小時內(nèi)完成PBMC分離，PBMC的活性才能有效的保留。有研究顯示，全血放置24h和48h會極大的顯著影響PBMC活性以及由抗原刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌。

在進(jìn)行疫苗臨床的細(xì)胞免疫原性評價時，首先推薦在臨床醫(yī)院采集新鮮的外周血后直接進(jìn)行PBMC的分離，即采即分，而后進(jìn)行檢測或放置液氮進(jìn)行長期保存，然而，臨床醫(yī)院通常不具備分離PBMC分離的環(huán)境、設(shè)備或人員操作，在疫苗大規(guī)模、多中心臨床研究中也無法做到操作統(tǒng)一和分離出來的PBMC質(zhì)量統(tǒng)一。其次，可以在臨床醫(yī)院采集外周血后在一定的時間內(nèi)運(yùn)輸至中心實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一進(jìn)行PBMC的分離和檢測，并對從全血采集到PBMC分離的放置時長進(jìn)行系統(tǒng)的驗(yàn)證，然而，對PBMC活性，運(yùn)輸時效性、物流費(fèi)用等臨床運(yùn)營均造成極大的挑戰(zhàn)。

PART 04

圖2 熙寧生物|精翰生物全血穩(wěn)定劑可將全血分離PBMC前放置時間延長至48小時

基于PBMC為研究對象極大了限制地疫苗的臨床細(xì)胞免疫原性研究?；谝呙绲呐R床試驗(yàn)中全血采集后穩(wěn)定性時長較短的難點(diǎn)，熙寧生物|精翰生物自主研發(fā)了一款全血穩(wěn)定劑，并經(jīng)過全血保存/分離條件的探索和驗(yàn)證，可將全血分離PBMC前的保存時間延長至48小時，如圖所示，ELISPOT檢測細(xì)胞因子分泌結(jié)果無顯著的變化，同時，PBMC放置液氮凍存6個月穩(wěn)定。

此外，由于PBMC穩(wěn)定性較差，且免疫背景較為復(fù)雜，使得ELISPOT/ICS的檢測結(jié)果的解析變得極為復(fù)雜，甚至很多時候檢測結(jié)果本身也有失真的風(fēng)險，因此，基于對方法和作用機(jī)理的充分理解，熙寧生物|精翰生物通過合理的樣品分組設(shè)計，方法學(xué)驗(yàn)證參數(shù)，以及建立完善的數(shù)據(jù)匯報體系，會對每一個臨床樣品的檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行解讀，充分保證數(shù)據(jù)的真是可靠。

圖3  熙寧生物|精翰生物細(xì)胞免疫原性評估和全流程管理

PART 05

熙寧生物|精翰生物具備完善的細(xì)胞免疫研究（ELISPOT和ICS）解決方案和數(shù)據(jù)匯報體系，自主開發(fā)的全血穩(wěn)定劑可解決疫苗細(xì)胞免疫研究臨床運(yùn)營痛點(diǎn)，在大樣本項(xiàng)目的管理方面擁有豐富的經(jīng)驗(yàn)，可提供完善的中心實(shí)驗(yàn)室服務(wù)。

與此同時，熙寧生物|精翰生物具有豐富的疫苗研究和抗傳染病領(lǐng)域研究經(jīng)驗(yàn)，具有完備的生物分析服務(wù)平臺，支持臨床和臨床前研究，可實(shí)現(xiàn)基于配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)合抗體檢測，基于活病毒或報告基因的中和抗體檢測，基于ELISPOT和ICS的細(xì)胞免疫檢測，以及基于PCR的病毒分型和載量的檢測，覆蓋呼吸道合胞病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、人乳頭瘤病毒、流感病毒、破傷風(fēng)毒素、乙肝病毒和治療性腫瘤疫苗等研究領(lǐng)域。未來，熙寧生物|精翰生物仍將根據(jù)臨床試驗(yàn)需求繼續(xù)開發(fā)更加準(zhǔn)確、靈敏、快捷以及解決臨床運(yùn)營痛點(diǎn)的檢測方法和解決方案，助力疫苗和抗傳染病領(lǐng)域臨床研究。

[1] Immunological mechanisms of vaccine-induced protection against COVID-19 in humans.

[2] A guide to vaccinology from basic principles to new developments.

[3] Cell-mediated immunity and the challenges for vaccine development.

[4] Reduction and functional exhaustion of T cells in patients with coronavirus disease 2019 (COVID-19).

[5] Deep immune profiling of COVID-19 patients reveals distinct immunotypes with therapeutic implications.

[6] Recruitment of highly cytotoxic CD8+ T cell receptors in mild SARS-CoV-2 infection.

[7] 新型冠狀病毒T細(xì)胞免疫的人群特征

[8] Virus-specific memory CD8 T cells provide substantial protection from lethal severe acute respiratory syndrome coronavirus infection.

[9] T-cell responses and therapies against SARS-CoV-2 infection.

[10] Targets of T cell responses to SARS-CoV-2 coronavirus in humans with COVID-19 disease and unexposed individuals.

[11] SARS-CoV-2-derived peptides define heterologous and COVID-19-induced T cell recognition.

[12] Robust T cell Immunity in convalescent individuals with asymptomatic or mild COVID-19.

[13] The T cell immune response against SARS-CoV-2.

[14] Immune Responses to Varicella-Zoster Virus Vaccines.

[15] 水痘-帶狀皰疹病毒的病原學(xué)及其相關(guān)疫苗的研究進(jìn)展.

[16] Immune Responses to a Recombinant Glycoprotein E Herpes Zoster Vaccine in Adults Aged 50 Years or Older.

[17] Immunogenicity of the Adjuvanted Recombinant Zoster Vaccine Persistence and Anamnestic Response to Additional Doses Administered 10 Years After Primary Vaccination.

[18] Long-term Protection Against Herpes Zoster by the Adjuvanted Recombinant Zoster Vaccine Interim Efficacy, Immunogenicity, and Safety Results up to 10 Years After Initial Vaccination.

[19] https://www.modernatx.com.

[20] Validation of Cell-Based Assays in the GLP Setting-VALIDATION OF THE IFN-γ ELISPOT ASSAY