PART 01

從結(jié)構(gòu)上來說，ADC是由單克隆抗體、連接子和小分子藥物構(gòu)成的多結(jié)構(gòu)域分子，通過ADC分子的抗體部位特異地結(jié)合到目標(biāo)細(xì)胞表面的靶抗原，介導(dǎo)內(nèi)化作用后進入細(xì)胞，再通過細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和溶酶體的作用釋放出小分子藥物發(fā)揮作用。與單獨使用抗體或小分子藥物相比，ADC 兼具了小分子與抗體藥物的雙重優(yōu)勢。

理想的ADC藥物能在循環(huán)系統(tǒng)中穩(wěn)定存在并能準(zhǔn)確到達靶標(biāo)部位，最終在靶標(biāo)位置釋放載荷。從靶點上來說，理想的靶點需要滿足兩個條件，一個是僅在靶標(biāo)細(xì)胞上表達或者主要在靶標(biāo)細(xì)胞上表達，第二個是在抗體結(jié)合后可以進行內(nèi)化。傳統(tǒng)的靶點是在腫瘤細(xì)胞上高表達的一些靶點，比如HER2、EGFR，目前也有一些較新的靶向腫瘤微環(huán)境的ADC靶點。從抗體上來說，為了更好的將ADC導(dǎo)向靶標(biāo)細(xì)胞，抗體需要考慮其親和力、靶點結(jié)合后內(nèi)吞入細(xì)胞的能力、免疫原性以及半衰期等。目前抗體端除了使用人源化的單抗以外，減少分子量以增加穿透性的抗體片段、增加靶向效率的雙表位或者雙靶點的雙抗也出現(xiàn)在不少ADC中。連接子也是非常重要的部分，直接決定了ADC的穩(wěn)定性以及在腫瘤細(xì)胞中釋放毒素的效率，包括可裂解和不可裂解兩種類型，不可裂解的連接子在循環(huán)系統(tǒng)中更穩(wěn)定，脫靶毒性較低；可裂解的連接子在小分子藥物釋放后可以發(fā)揮旁觀者效應(yīng)，增加效果。小分子藥物主要是針對腫瘤適應(yīng)癥的毒素，例如微管蛋白抑制劑、DNA損傷劑，或者是一些針對自身免疫適應(yīng)癥的激素類調(diào)節(jié)分子，目前也有一些ADC藥物同時連接兩種不同的小分子藥物協(xié)同發(fā)揮藥效。

ADC藥物發(fā)展至今共經(jīng)歷了三代技術(shù)的變革，在穩(wěn)定性、DAR（小分子藥物和抗體的結(jié)合比）值均一性、CMC特性、抗腫瘤活性上都在不斷改善，治療窗口也在不斷擴大。尤其是第三代的ADC，由于定點偶聯(lián)技術(shù)的發(fā)展，在很大程度上改進了DAR值均一性的問題，改善了ADC藥物的藥代動力學(xué)特性。

PART 02

本質(zhì)上來說，ADC藥物是一個不均一的混合物。不同的DAR值，同樣DAR值不同的偶聯(lián)位點，都可能產(chǎn)生不同的分子。在進入體內(nèi)以后，一方面ADC分子可能會因為體內(nèi)的降解而產(chǎn)生相應(yīng)的變化，另一方面不同DAR值的ADC分子可能會有不同的清除率，所以隨著給藥時間的推移，不同采樣點上ADC的DAR值分布和開始給藥的ADC藥物可能會有很大的不同，尤其是在比較靠后的時間點。

隨著ADC分子在體內(nèi)的代謝變化，最終會形成不同的檢測物形式，主要是不同DAR值的完整的ADC分子、沒有連接小分子藥物的裸抗、游離的小分子藥物及其代謝物。那在臨床生物分析檢測時，重點需要關(guān)注檢測哪些形式呢？可以先看一下已上市的ADC藥物的相關(guān)信息。

表1  已上市ADC藥物臨床PK檢測形式總結(jié)

從上表的總結(jié)可以看出，在目前全球上市的15款A(yù)DC藥物的臨床PK檢測上，絕大部分檢測的是總抗體（PK-TAb）、ADC（PK-ADC）和游離小分子藥物（PK-Payload）這三項。在檢測方法上，通常使用LBA方法檢測總抗體和ADC，少量上市藥物使用LC-MS進行檢測，游離小分子藥物均使用LC-MS方法檢測。

PART 03

從ADC的代謝特征上來看，目前ADC藥物總體而言表現(xiàn)的是類似抗體的特征，比如較低的清除率、較長的半衰期、低分布容積、非線性分布和消除等。

對于反映ADC藥物PK特征的總抗體和ADC的檢測，目前LBA是最常用的檢測方式，從方法設(shè)計上來說，對于總抗體，可以使用一對試劑對來分別作為捕獲和檢測試劑，這里的試劑可以考慮使用特異性的抗ADC抗體端的抗體、靶點蛋白、通用型的抗IgG抗體。對于ADC的檢測，通常使用抗小分子藥物的抗體作為捕獲試劑，再使用抗ADC抗體端的抗體、靶點蛋白或者通用型的抗IgG抗體作為檢測試劑進行試劑配對組合。

圖1  ADC藥物-TAb & ADC 方法設(shè)計

由于ADC藥物的PK需要檢測TAb和ADC兩種不同的形式，為了最大程度的保證兩種不同形式檢測結(jié)果的可比性，需要在方法開發(fā)中重點考慮DAR值敏感性和靶點干擾對檢測的影響， 并在開發(fā)中最大程度保證兩種方法的一致性。

ADC藥物在進入體內(nèi)以后，會有一系列的代謝轉(zhuǎn)化。一方面ADC分子中的毒素可能會在循環(huán)系統(tǒng)脫落或部分脫落，另一方面不同DAR值的ADC分子可能會有不同的清除率，通常DAR值更大的分子清除率更快。所以從ADC分子的變化來說，隨著時間的推移，分析物本身的DAR值分布總體而言會有降低的趨勢。在分析方法開發(fā)時，使用不同DAR值標(biāo)準(zhǔn)品進行測試，選擇DAR值不敏感的分析方法就是一個保證樣品結(jié)果可比性的關(guān)鍵點。

例如上表中的例子，在該例子中，ADC的平均DAR值是4，從不同配對試劑的結(jié)果來看，對于總抗體的測試數(shù)據(jù)，其試劑配對1在低DAR值標(biāo)準(zhǔn)品及裸抗檢測時，測定結(jié)果明顯偏低，試劑配對2受DAR值影響較??；對于ADC的方法而言，其試劑配對1受DAR值影響較小，但試劑配對2在檢測低DAR值標(biāo)準(zhǔn)品時明顯結(jié)果偏低。在這個例子中，如果我們在總抗體和ADC的檢測上，都選擇其相應(yīng)的試劑配對1，在實際的樣品檢測中，很可能會出現(xiàn)ADC濃度大于總抗體的情況，因為總抗體檢測結(jié)果在DAR值變低后是偏低的。另外，如果我們在總抗體和ADC的檢測上，都選擇其相應(yīng)的試劑配對2，結(jié)果很可能會出現(xiàn)ADC濃度明顯低于總抗體的情況，看上去像是ADC分子的毒素有很多全部脫落了，但其實和方法學(xué)也有不小的關(guān)系。

從上面的討論中，我們可以看出，ADC臨床檢測中出現(xiàn)的有些不合邏輯的問題，是可以在方法學(xué)中找到原因的，我們也可以通過前期方法學(xué)更細(xì)致的設(shè)計和測試，選擇最優(yōu)的方法形式以免在樣品檢測中出現(xiàn)問題。就如上面這個例子，最終正確的選擇顯然是用總抗體的試劑配對2進行總抗體的檢測，ADC的試劑配對1進行ADC的檢測，這樣才能保證方法學(xué)檢測不同DAR值A(chǔ)DC產(chǎn)物的一致性。

ADC藥物是靶向細(xì)胞上的靶點，靶點通常在循環(huán)系統(tǒng)中濃度并不是很高，因此靶點干擾的問題經(jīng)常容易被忽視。但在實際的項目中，一方面部分靶點在循環(huán)系統(tǒng)中的濃度并不低，例如BCMA，濃度在幾百ng/mL；又例如HER2，在部分高表達患者中，循環(huán)系統(tǒng)中能到達μg/mL水平；另一方面，很多靶點在給藥后循環(huán)系統(tǒng)中的總濃度會增加，這些都會增加靶點對方法的影響，尤其是對一些樣品濃度低的采樣點，如果分析方法在總抗體和ADC方法的靶點耐受上差異很大，很可能也會造成檢測結(jié)果的不一致。

總體而言，對于靶點干擾的問題，需要我們在方法設(shè)計時關(guān)注總抗體和ADC方法檢測的藥物形式是否有差別，也就是我們在單抗檢測中的total和free的問題。那另外就是在開發(fā)階段，需要進行靶點干擾的測試，選擇不受靶點預(yù)期濃度干擾的方法形式，或者選擇靶點對總抗體和ADC干擾程度近似的方法形式。

對于總抗體和ADC的檢測，在方法層面上盡可能保證一致性，也能更好的保證樣品在檢測上的一致性。例如，除包被試劑不同外，盡可能使用相同的緩沖液和檢測試劑；方法參數(shù)（定量范圍、MRD等）及操作盡可能一致。在定量范圍一致的情況下，推薦使用同一批標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品進行總抗體和ADC的檢測，以減少配制帶來的差異。

PART 04

熙寧生物|精翰生物在ADC藥物的檢測上積累了豐富的經(jīng)驗，涵蓋ADC藥物的熱門靶點EGFR、HER2、FRα、Trop2、Nectin-4、B7-H3等等，目前有20多種ADC藥物正在熙寧|精翰進行檢測分析，歡迎感興趣的朋友在后臺留言咨詢。