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前言
細(xì)胞因子是一類維持機體自身免疫系統(tǒng)穩(wěn)定并調(diào)控生理病理過程的重要因子，不同的細(xì)胞因子在體內(nèi)會形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，若調(diào)控出現(xiàn)失衡，則有可能出現(xiàn)多種疾病。對細(xì)胞因子的檢測和及時的動態(tài)監(jiān)測可以幫助及早發(fā)現(xiàn)、診斷、對癥治療相關(guān)疾病，也是個性化治療、精準(zhǔn)醫(yī)療、合理用藥的重要內(nèi)容。
細(xì)胞因子的定義和功能特點
細(xì)胞因子是由免疫原、絲裂原或其他刺激劑誘導(dǎo)免疫細(xì)胞以及一些非免疫細(xì)胞合成分泌產(chǎn)生的分子量相對較低的可溶性蛋白質(zhì)，分子量通常在6-70kD，大多數(shù)在15-30kD之間。
從功能上來說，細(xì)胞因子能在細(xì)胞間傳遞信息，通過結(jié)合細(xì)胞表面的相應(yīng)受體而發(fā)揮生物學(xué)作用?？傮w而言，其生物學(xué)活性十分廣泛，參與人體多種重要的生理功能，例如調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫、血細(xì)胞生成、細(xì)胞生長、損傷組織修復(fù)等。
從作用特點上來說，細(xì)胞因子通常是由抗原等刺激物激活相關(guān)細(xì)胞才合成和分泌，其合成和分泌的過程也是一種自我調(diào)控的過程，在刺激后會迅速合成，并立即分泌至細(xì)胞外從而發(fā)揮生物學(xué)作用，后續(xù)也會被迅速降解。刺激消失后合成會很快停止，也就是說，總體而言，細(xì)胞因子作用的窗口期短，半衰期短，敏感性強。在體內(nèi)，細(xì)胞因子主要是以非特異性的方式來發(fā)揮作用，會形成非常復(fù)雜的多相性網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)，比如多效性、重疊性、協(xié)同性、拮抗性等。
細(xì)胞因子檢測的意義
作為多種疾病的生物標(biāo)志物，細(xì)胞因子的檢測在很多疾病領(lǐng)域都有重要的意義，尤其是在感染類疾病、惡性腫瘤和自身免疫類疾病上。在感染類疾病中，細(xì)胞因子可以用于診斷早期感染、膿毒癥的快速篩查、呼吸機相關(guān)性肺炎的篩查、鑒別G-/G+菌感染、評估病毒感染患者的病情嚴(yán)重程度等。惡性腫瘤方面，細(xì)胞因子可以用于評估腫瘤微環(huán)境進(jìn)展，輔助腫瘤早期診斷、預(yù)測免疫治療療效以及化療和手術(shù)的預(yù)后預(yù)測等。在自身免疫性疾病上，細(xì)胞因子在噬血細(xì)胞綜合癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、過敏性紫癜、自身免疫性肝炎等疾病上均有應(yīng)用。
除了上述三個疾病領(lǐng)域以外，細(xì)胞因子的檢測在其它領(lǐng)域也有很多的應(yīng)用，比如輔助篩查流產(chǎn)病因，監(jiān)測移植排斥與免疫、指導(dǎo)臨床激素和抗炎藥的應(yīng)用，在重癥急性胰腺炎、氣道炎癥、燒傷、以及醫(yī)美領(lǐng)域的應(yīng)用等等。
另外值得單獨一提的和細(xì)胞因子相關(guān)的就是細(xì)胞因子風(fēng)暴，膿毒癥、重癥感染、噬血細(xì)胞綜合征、腫瘤免疫治療、罕見變異病毒感染或大手術(shù)患者均可引起細(xì)胞因子風(fēng)暴。監(jiān)測細(xì)胞因子可以為及時治療和預(yù)警細(xì)胞因子風(fēng)暴風(fēng)險，幫助區(qū)分細(xì)胞因子風(fēng)暴的免疫狀態(tài)提供很大的幫助，提高患者治療的有效率。在CDE發(fā)布的藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則中，也有對免疫調(diào)節(jié)類藥物進(jìn)行細(xì)胞因子釋放實驗的要求，以提前對免疫調(diào)節(jié)類藥物造成的細(xì)胞因子釋放風(fēng)險進(jìn)行考察。
細(xì)胞因子檢測的影響因素和難點
靈敏度要求高
大部分的細(xì)胞因子在體內(nèi)的含量是非常低的，通常在pg/mL的水平上，正常人有時甚至?xí)趂g/mL的水平上，例如IL-2，IL-4?；颊唧w內(nèi)的細(xì)胞因子濃度可能會有所增加，不同的疾病類型，細(xì)胞因子的濃度差別也很大。在進(jìn)行檢測方法的開發(fā)時，我們需要基于分析目的和人群的細(xì)胞因子濃度分布來確定方法的靈敏度。由于靈敏度的高要求，對于細(xì)胞因子檢測的檢測試劑，主要是細(xì)胞因子的檢測抗體的親和力要求還是很高的，使用親和力低的抗體往往達(dá)不到目標(biāo)靈敏度。
缺少標(biāo)準(zhǔn)化的檢測方法
總體而言，細(xì)胞因子的方法也是使用重組蛋白進(jìn)行的相對定量方法，不管是自建的還是商業(yè)化的試劑盒，在方法性能上，不同的方法差異很大，比如方法的重現(xiàn)性、準(zhǔn)確度和精密度、關(guān)鍵試劑變更或者條件變更時的穩(wěn)固性等。參照品的選擇在不同的方法也很不相同，所以對于細(xì)胞因子的方法，不同方法間檢測結(jié)果的差異往往也很難對比，也就是很難有一個統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的檢測方法，這個也是目前細(xì)胞因子檢測上經(jīng)常遇到的問題，例如在IL-10的檢測項目上，不同的試劑盒檢測出來的結(jié)果有的在0點幾到幾pg/mL之間，有的在幾十pg/mL，還有的在幾百pg/mL，甚至是同一個廠商的不同貨號的試劑盒，結(jié)果差異有時也很大。所以在選擇細(xì)胞因子的試劑盒時，也不能僅僅只關(guān)注靈敏度的數(shù)值，關(guān)注細(xì)胞因子方法的樣品檢出率會更有意義。
基質(zhì)的影響和干擾
從影響細(xì)胞因子定量結(jié)果的因素上來說，除了分析方法的差異，細(xì)胞因子在基質(zhì)環(huán)境中受到的干擾也對結(jié)果有很大的影響。例如可以和細(xì)胞因子結(jié)合的蛋白、抑制劑和可溶性的細(xì)胞因子受體，也是我們在方法開發(fā)的時候需要關(guān)注的重點。對于一些特殊的細(xì)胞因子，在檢測試劑的選擇上還要有特殊的考量，以區(qū)分基質(zhì)中存在的類似結(jié)構(gòu)的其他物質(zhì)。
一些生物基質(zhì)中的干擾物質(zhì)也可以和檢測的試劑結(jié)合產(chǎn)生假陽性的信號，比如類風(fēng)濕因子、異嗜性抗體、補體等等。在方法開發(fā)時也要選擇合適的稀釋液和檢測試劑以消除或減輕這些干擾。另外，生物樣本的處理過程也可能會對結(jié)果有影響，不同的基質(zhì)中細(xì)胞因子的濃度也往往會有差異。例如TGFβ1、VEGF、TNFα等，在不少文獻(xiàn)中都有報道，在血清和血漿中檢測出的濃度是不同的，很可能是由于凝血過程中血小板活化釋放導(dǎo)致。
細(xì)胞因子的檢測平臺
在細(xì)胞因子的檢測平臺上，主要是以體外檢測的平臺為主，當(dāng)然目前也有一些基于生物傳感裝置的體內(nèi)檢測平臺，但大多都還是在較為早期的研究階段。
從主要的體外檢測平臺來說，ELISA、MSD、Luminex、流式、Simoa應(yīng)用的較為廣泛，每個平臺也有他自身的優(yōu)勢。ELISA的成本低，可選擇的商業(yè)化試劑盒多，平臺的普及度高。MSD平臺靈敏度高，線性范圍寬，而且可以多組分同時檢測，樣品用量小。Luminex的靈活性最高，例如Luminex 200理論上最多可以同時檢測100種組分。流式的優(yōu)勢是可以對胞內(nèi)的細(xì)胞因子濃度進(jìn)行檢測，而且也可以多組分檢測。Simoa平臺則是所有平臺中靈敏度最高的，可以定量檢測fg/mL水平的細(xì)胞因子。
從臨床檢測上來說，目前更多的項目在細(xì)胞因子的檢測上會優(yōu)先考慮一些多因子的檢測平臺，這個也是由于疾病發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜性，單一生物標(biāo)志物很可能不能充分反應(yīng)疾病的狀態(tài)，對于多個細(xì)胞因子均采用單獨檢測的方式的成本會很高，對樣品量的要求也很大，所以多因子的檢測平臺會更有優(yōu)勢。目前最主要的多因子檢測平臺是Luminex和MSD，在靈活組合的同時也可以保證一定的檢測靈敏度。
細(xì)胞因子方法開發(fā)考察項
對于細(xì)胞因子的方法而言，最主要的一些考察項包括標(biāo)準(zhǔn)曲線、個體基質(zhì)濃度分布、平行性和選擇性、方法的特異性、QC定值、準(zhǔn)確度和精密度、稀釋線性和鉤狀效應(yīng)、穩(wěn)固性和穩(wěn)定性。對于不同的分析目的，考察項的側(cè)重也可以有所不同。要求比較高的全驗證的方法，通常是作為提交監(jiān)管申報的數(shù)據(jù)檢測方法，需要盡可能考察的全面一些，對于探索性的目的，則可以從成本出發(fā)，主要關(guān)注方法的一些關(guān)鍵項，比如平行性、選擇性、準(zhǔn)確度和精密度、穩(wěn)定性。平行性是判斷方法基質(zhì)效應(yīng)的關(guān)鍵，不過很多細(xì)胞因子由于內(nèi)源性濃度太低，在方法學(xué)階段無法進(jìn)行平行性測試，可以先使用選擇性的測試來進(jìn)行。對于稀釋線性和鉤狀效應(yīng)的考察，也可以基于內(nèi)源性的濃度預(yù)測來判斷是否有考察的必要。另外，基于成本的考慮，QC定值也可以采取不同的策略，例如和準(zhǔn)確度精密度分析批同時進(jìn)行。
熙寧|精翰生物自主研發(fā)的細(xì)胞因子方法
熙寧|精翰生物在主流的細(xì)胞因子檢測平臺(ELISA、MSD、Luminex、流式、Simoa等)均有布局，積累了大量的細(xì)胞因子檢測經(jīng)驗，對于常見的細(xì)胞因子也已開發(fā)相應(yīng)的自主產(chǎn)權(quán)方法，例如熙寧生物自主研發(fā)的7因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFNγ、TNFα)方法學(xué)，可用于細(xì)胞因子釋放實驗及臨床血清樣品的檢測，可以為申辦方省去方法學(xué)建立的時間，并大大減少方法學(xué)和后續(xù)檢測的試劑成本。
熙寧生物已有生物標(biāo)志物自主產(chǎn)權(quán)方法（部分）
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