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熙寧小課-第75期 | 整合位點(diǎn)分析,基因和細(xì)胞治療的安全指南
發(fā)布作者:熙寧生物發(fā)布時(shí)間:2022-07-08

基因治療和細(xì)胞治療

1990年美國(guó)醫(yī)學(xué)家W.F. Anderson對(duì)患有腺苷脫氨酶缺乏癥的4歲女孩進(jìn)行基因治療,成為世界上首個(gè)基因治療成功的范例和重要里程碑。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展,基因治療為患者“從根本上進(jìn)行疾病治療”帶來(lái)了新的希望。

按照治療方式,基因治療可分為2類,體內(nèi)治療是直接向血液或者目標(biāo)器官中注射攜帶所需基因的載體,如單基因遺傳病、血友病及眼科疾病領(lǐng)域的應(yīng)用。體外治療,又可稱為細(xì)胞治療,是把患者的細(xì)胞從體內(nèi)移出,通過(guò)在體外對(duì)于細(xì)胞進(jìn)行基因改造,重新輸入至患者的體內(nèi)。其中嵌合抗原受體T細(xì)胞療法(CAR-T)是一種治療腫瘤的新型精準(zhǔn)靶向療法。

截至目前,已有20余款基因治療藥物和 8款CAR-T產(chǎn)品獲得各國(guó)藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)?;蚝图?xì)胞治療藥物憑借先進(jìn)的生物技術(shù)和廣闊的治療前景,將在未來(lái)人類疾病的防治中發(fā)揮重要作用。

慢病毒整合

對(duì)于基因和細(xì)胞治療而言,基因遞送的方式和效率直接決定了藥物的治療效果,因此載體的選擇顯得尤為重要。由于感染譜廣泛,可以有效感染分裂期和靜止期細(xì)胞,長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)外源基因,慢病毒系統(tǒng)被廣泛地應(yīng)用于基因和細(xì)胞治療等實(shí)驗(yàn)中。

病毒整合是慢病毒正常生活周期(Lifecycle)的重要環(huán)節(jié)(圖1)。病毒識(shí)別宿主細(xì)胞表面受體,將RNA及蛋白轉(zhuǎn)移至胞內(nèi)。隨后RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA,整合酶識(shí)別病毒DNA攜帶的LTR,以隨機(jī)或半隨機(jī)方式切斷宿主基因組,產(chǎn)生的粘性末端會(huì)與病毒DNA連接,從而完成外源基因的插入。病毒整合是外源基因表達(dá)、實(shí)現(xiàn)基因治療效果的必要條件。

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圖1 慢病毒生活周期(Lifecycle)

病毒載體整合至宿主細(xì)胞基因組,可能破壞基因組的內(nèi)源性基因表達(dá)1。隨著研究的進(jìn)一步深入,科學(xué)家發(fā)現(xiàn)慢病毒等逆轉(zhuǎn)錄病毒的整合不是完全隨機(jī)的,其中慢病毒整合更容易發(fā)生在活躍轉(zhuǎn)錄的基因中,存在致病的潛在風(fēng)險(xiǎn)2。2005年巴黎進(jìn)行的治療X連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)的臨床試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在接受基因治療的患者中出現(xiàn)明顯的白血病或惡性克隆擴(kuò)增的癥狀3。

對(duì)于CAR-T細(xì)胞治療,研究顯示部分病毒插入突變與治療后復(fù)發(fā)相關(guān)。Shah et al2等報(bào)道一名急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL)患者,接受抗CD22 CAR-T細(xì)胞療法后復(fù)發(fā),可能是由于CAR意外插入CBL基因、53天后出現(xiàn)的二次克隆擴(kuò)增。Ruella et al4等報(bào)道一名ALL患者接受CAR-CD19治療的復(fù)發(fā),發(fā)現(xiàn)一個(gè)攜帶CAR插入位點(diǎn)的CAR-B細(xì)胞克隆,研究人員最終確定,癌變B細(xì)胞里的CAR是制作CTL019細(xì)胞時(shí)意外引入的。癌變的B細(xì)胞獲得了CAR,便遮擋了CD19,CAR-T因此無(wú)法識(shí)別癌細(xì)胞。

整合位點(diǎn)分析的法規(guī)要求

基于整合載體的潛在致病性,國(guó)內(nèi)外法規(guī)均有相關(guān)安全性分析的條款。美國(guó)FDA 最新發(fā)布《嵌合抗原受體(CAR)T 細(xì)胞治療的研發(fā)考量》,指出“對(duì)包括整合載體的產(chǎn)品推薦進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪,因?yàn)檎陷d體可能會(huì)增加延遲不良事件的風(fēng)險(xiǎn)”。EMA和IHC等機(jī)構(gòu)同樣推薦在治療過(guò)程中或者長(zhǎng)期隨訪中,分析整合位點(diǎn)。

國(guó)家藥監(jiān)局5月最新推出《免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》明確指出,“基因插入位點(diǎn)和拷貝數(shù):由于其關(guān)系到產(chǎn)品的安全性和有效性,需采用適用的檢測(cè)方法進(jìn)行研究,探索其與安全性和療效的相關(guān)性”。同期發(fā)布的《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》指出,“分析載體在基因組中的整合方式和整合位點(diǎn)的分布趨勢(shì),評(píng)估其插入導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生基因突變、基因失活/激活,或細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)”。

病毒整合位點(diǎn)分析方法

病毒整合最初采用Southern blot和基因組文庫(kù)來(lái)分析整合位點(diǎn)特征5。 PCR技術(shù)因操作簡(jiǎn)單,結(jié)果準(zhǔn)確,逐漸取代Southern blot成為病毒整合的主要分析方法。根據(jù)PCR技術(shù)路線差異,病毒整合主要分為反向PCR(Reverse PCR)、接頭PCR(Ligated Mediated PCR, LM-PCR)和線性擴(kuò)增PCR(Linear Amplification Mediated PCR, LAM-PCR)等。

反向PCR,將DNA酶切打斷后連接成環(huán),設(shè)計(jì)反向引物擴(kuò)增,可得到病毒整合位點(diǎn)兩側(cè)的未知序列。由于連接酶成環(huán)效率較低,反向PCR使用受限。LM-PCR,在DNA酶切打斷后,兩端連接含接頭,根據(jù)病毒DNA和接頭固定序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增,即解鎖病毒整合位點(diǎn)的位置信息(圖2)。LM-PCR原理簡(jiǎn)單,易于操作,從發(fā)明之日起應(yīng)用至今。LAM-PCR,首先線性擴(kuò)增DNA,擴(kuò)增得到的單鏈產(chǎn)物通過(guò)LM-PCR將單鏈擴(kuò)增的特異性產(chǎn)物繼續(xù)放大。由于引入線性擴(kuò)增,LAM-PCR的靈敏度和特異性極大提高,超過(guò)反向PCR和LM-PCR,應(yīng)用廣泛(圖2)。

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圖2 反向PCR、LM-PCR和LAM-PCR技術(shù)路線示意圖

傳統(tǒng)PCR技術(shù)分析整合位點(diǎn)依賴限制性內(nèi)切酶酶切,存在一定偏好性;同時(shí)電泳或者一代測(cè)序靈敏度較低,分析克隆數(shù)量有限。隨著2005年第一臺(tái)高通量測(cè)序儀羅氏454問(wèn)世,二代測(cè)序(NGS)逐步取代PCR,成為整合位點(diǎn)分析的主流技術(shù)。由于測(cè)序數(shù)據(jù)量大,二代測(cè)序極大地?cái)U(kuò)展了整合位點(diǎn)數(shù)量,特別是低頻整合克隆的檢出,為藥物開發(fā)提供更多可參考信息。

高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建流程與PCR相比更為復(fù)雜。常用文庫(kù)構(gòu)建方法包括LM-PCR、LAM-PCR和非限制性酶切LAM-PCR(nrLAM-PCR)等(nrLAM-PCR以LAM-PCR為基礎(chǔ),剔除了內(nèi)切酶酶切操作)。LAM-PCR和nrLAM-PCR方式建庫(kù),在線性擴(kuò)增中引入生物素標(biāo)記引物和鏈霉親和素標(biāo)記磁珠,流程復(fù)雜,成本較高6。LM-PCR通過(guò)2步PCR富集插入位點(diǎn)序列,6~7h即可完成建庫(kù),操作簡(jiǎn)單,大大加快建庫(kù)周期,是慢病毒插入位點(diǎn)檢測(cè)的理想選擇。

熙寧生物最新推出慢病毒整合位點(diǎn)NGS檢測(cè)技術(shù)bLM-PCR。bLM-PCR以LM-PCR技術(shù)為基礎(chǔ),與其他建庫(kù)方法相比,操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)周期短且成本低廉。此外,慢病毒兩端各有一個(gè)LTR序列,兩個(gè)LTR均通過(guò)LM-PCR發(fā)生擴(kuò)增,因此常規(guī)建庫(kù)方法有一半reads是LTR與Provirus(前病毒插入序列)的無(wú)用整合信息。熙寧bLM-PCR通過(guò)引入靶向Provirus的特異性探針(圖3 blocker),阻斷5’LTR無(wú)效整合位點(diǎn)reads的擴(kuò)增,可節(jié)省一半的測(cè)序數(shù)據(jù)量和一半的測(cè)序成本。

歡迎垂詢!

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圖3 bLM-PCR建庫(kù)技術(shù)路線

參考文獻(xiàn)

1.Desfarges, S. & Ciuffi, A. Retroviral integration site selection. Viruses 2, 111–130 (2010).

2.Shah, N. N. et al. Clonal expansion of CAR T cells harboring lentivector integration in the CBL gene following anti-CD22 CAR T-cell therapy. Blood Adv. 3, 2317–2322 (2019).

3.孟坡. 慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)研究方法. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志 5, 42–64 (2008).

4.Med, N. et al. Induction of resistance to chimeric antigen receptor T cell therapy by transduction of a single leukemic B cell. Nat. Med. 24, 1499–1503 (2019).

5.Nusse, R. et al. Retroviral insertional mutagenesis in murine mammary cancer. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 226, 3–13 (1985).

6.Hamada, M. et al. Integration Mapping of piggyBac-Mediated CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Analyzed by Novel Tagmentation-Assisted PCR. EBioMedicine vol. 34 18–26 (2018).

熙寧生物按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》、《分子病理診斷實(shí)驗(yàn)室建設(shè)指南(試行)》和《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則》要求建立NGS實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室配備illumina CN500測(cè)序儀(注冊(cè)備案)、Covaris M220基因打斷儀和安捷倫自動(dòng)化電泳儀4150等儀器,可完成常規(guī)文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序?qū)嶒?yàn)。技術(shù)團(tuán)隊(duì)核心人員有5-10年NGS方法開發(fā)經(jīng)驗(yàn),曾在頭部基因檢測(cè)公司牽頭完成腫瘤大panel檢測(cè)、全外顯子測(cè)序和RNAseq等項(xiàng)目。


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