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熙寧小課-第83期 | 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(ELISPOT)在細(xì)胞治療、基因治療和疫苗研發(fā)中的應(yīng)用
發(fā)布作者:熙寧生物發(fā)布時(shí)間:2022-10-01

前言

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(Enzyme Linked Immunospot Assay,簡(jiǎn)稱ELISPOT)是細(xì)胞免疫學(xué)研究中最為敏感的檢測(cè)方法,可以在單細(xì)胞水平對(duì)抗體分泌細(xì)胞(如B細(xì)胞)及細(xì)胞因子分泌細(xì)胞(如T細(xì)胞)進(jìn)行檢測(cè),該方法有極高的靈敏度,可達(dá)20-25斑點(diǎn)/100萬(wàn)細(xì)胞,并且該方法能夠?qū)乖碳ず蟮幕罴?xì)胞進(jìn)行功能性檢測(cè),是疫苗領(lǐng)域藥效評(píng)估的關(guān)鍵檢測(cè)方法。隨著生物藥領(lǐng)域向腫瘤免疫深入邁進(jìn),ELISPOT技術(shù)也逐步成為基因治療,細(xì)胞治療(CART, TCRT),抗體/雙特異抗體藥物的生物分析領(lǐng)域的主流技術(shù)。


酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)的基本流程

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)的基本原理是通過(guò)免疫細(xì)胞和對(duì)應(yīng)的刺激物進(jìn)行共培養(yǎng),然后使用類似于ELISA雙抗夾心法對(duì)有刺激反應(yīng)的免疫細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。由于免疫細(xì)胞激活機(jī)理的復(fù)雜性性,根據(jù)免疫細(xì)胞的來(lái)源選擇,刺激物的類型,刺激方式的不同會(huì)衍生出不同應(yīng)用方向,不同靈敏度的ELISPOT檢測(cè)方法,其簡(jiǎn)要的流程如圖1所示

      

圖片40.png 

圖1:ELISPOT技術(shù)基本操作流程


ELISPOT技術(shù)用于疫苗藥效學(xué)評(píng)估

目前ELISPOT技術(shù)最為廣泛應(yīng)用的領(lǐng)域是用于感染性疫苗的臨床階段的藥效學(xué)評(píng)估,通常采用感染性病毒受體片段多肽庫(kù)(如新冠S蛋白多肽庫(kù))作為刺激物,通常取臨床受試者的免疫細(xì)胞進(jìn)行共孵育培養(yǎng),通常為T細(xì)胞,有時(shí)會(huì)將T細(xì)胞進(jìn)行細(xì)分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞,示例如下圖2康希諾生物Ad5載體重組蛋白新冠疫苗和輝瑞/BioNTech mRNA新冠疫苗使用ELISPOT技術(shù)用于疫苗的細(xì)胞免疫藥效學(xué)評(píng)估。

圖片41.png

圖2:ELISPOT技術(shù)用于感染性疫苗的藥效學(xué)評(píng)估

 

 

ELISPOT技術(shù)也是腫瘤疫苗進(jìn)行臨床階段的藥效學(xué)評(píng)估的重要檢測(cè)和篩選技術(shù)。相對(duì)于感染性疫苗,腫瘤疫苗引起人體的免疫反應(yīng)較弱,同時(shí)由于腫瘤的異質(zhì)性,腫瘤疫苗需要表達(dá)多樣化的腫瘤相關(guān)抗原或者新生抗原來(lái)使患者獲得對(duì)于腫瘤的免疫能力。ELISPOT技術(shù)基于其高靈敏性是腫瘤疫苗進(jìn)行早期藥效學(xué)評(píng)估,判斷疫苗中各個(gè)相關(guān)抗原或者新生抗原是否對(duì)人體有效,支持后續(xù)的臨床決策非常關(guān)鍵的檢測(cè)技術(shù),如圖3某DC腫瘤疫苗在單一腫瘤相關(guān)抗原多肽刺激下的T細(xì)胞免疫反應(yīng)。

圖片42.png 

圖3:ELISPOT技術(shù)用于腫瘤疫苗腫瘤相關(guān)抗原的評(píng)估

 

在CDE發(fā)布的《新型冠狀病毒預(yù)防用mRNA疫苗藥學(xué)研究》指導(dǎo)原則中如圖4同時(shí)也強(qiáng)調(diào)了mRNA疫苗的質(zhì)量研究需要進(jìn)行體內(nèi)效力試驗(yàn),推薦使用ELISPOT技術(shù)檢測(cè)評(píng)價(jià)mRNA疫苗的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

圖片43.png 

圖4:mRNA疫苗藥學(xué)生物活性研究?jī)?nèi)容


ELISPOT技術(shù)用于CART的免疫原性評(píng)估

CART細(xì)胞免疫療法是將來(lái)自人體的T細(xì)胞經(jīng)過(guò)基因編輯,安裝上能夠識(shí)別腫瘤細(xì)胞的特異性蛋白受體,然后擴(kuò)增后回輸回人體。由于基因編輯后的CART細(xì)胞能夠持續(xù)在人體擴(kuò)增,并且特異性的識(shí)別腫瘤細(xì)胞,起到殺傷病人體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的作用,CART在人體的持續(xù)擴(kuò)增和存續(xù)是CART細(xì)胞免疫療法取得杰出療效的關(guān)鍵,而人體針對(duì)CART細(xì)胞的免疫原性是影響CART細(xì)胞擴(kuò)增存續(xù)的關(guān)鍵因素。目前上市靶向CD19的幾款CART產(chǎn)品其特異性蛋白受體均是鼠源的FCM63 scFV,有較強(qiáng)的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。關(guān)于文獻(xiàn)披露的FCM63 scFV是否存在免疫原性,每個(gè)上市CART產(chǎn)品測(cè)定的ADA發(fā)生率差異較大,但整體的結(jié)論是ADA不影響藥效。

目前上市的CART其適應(yīng)癥均在血液腫瘤領(lǐng)域,在實(shí)體瘤領(lǐng)域鮮有突破,對(duì)此Wagner,2021在Immunogenicity of CAR T cells in cancer therapy的綜上中提到了一個(gè)可能的原因,由于現(xiàn)有的CART產(chǎn)品主要是靶向清除B細(xì)胞,同時(shí)在治療前均進(jìn)行了清除淋巴細(xì)胞的處理,


CART產(chǎn)品注射后由于人體免疫細(xì)胞的缺失不會(huì)產(chǎn)生對(duì)CART細(xì)胞的免疫原性,短時(shí)間不會(huì)影響到CART的療效。隨著人體免疫系統(tǒng)的恢復(fù),即使人體潛在存在針對(duì)CART的免疫原性,由于CART細(xì)胞會(huì)持續(xù)殺傷B細(xì)胞,中短期不會(huì)影響到CART的療效,但是針對(duì)CART的免疫原性T細(xì)胞會(huì)最終影響到CART的存續(xù),影響到CART產(chǎn)品的長(zhǎng)期藥效。同時(shí)文獻(xiàn)記載針對(duì)B細(xì)胞血液瘤的CART產(chǎn)品再次回輸不會(huì)取得很好的療效也是潛在CART免疫原性會(huì)影響到藥效的佐證。而在實(shí)體瘤領(lǐng)域,CART產(chǎn)品注射后人體如果產(chǎn)生了免疫原性,人體的B細(xì)胞會(huì)分泌針對(duì)CART的中和抗體,阻斷CART細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞,人體的T細(xì)胞會(huì)攻擊CART細(xì)胞,影響到CART細(xì)胞的大量擴(kuò)增和存續(xù),進(jìn)而影響到CART產(chǎn)品針對(duì)實(shí)體瘤的療效。總結(jié)來(lái)說(shuō),免疫原性是影響到CART療效,特別是實(shí)體瘤療效,以及是否能再次回輸?shù)年P(guān)鍵因素之一,如圖5。

圖片44.png

圖5:免疫原性對(duì)血液腫瘤和實(shí)體瘤CART療效的影響

 

Brudno在2020年發(fā)表過(guò)對(duì)比試驗(yàn),使用ELISSOT技術(shù)檢測(cè)CART產(chǎn)品的免疫原性,評(píng)估攜帶FCM63的CART和全人anti-CD19的CART產(chǎn)品對(duì)于CART產(chǎn)品的存續(xù)的影響,如下圖,總結(jié)來(lái)說(shuō)全人抗CD19 CART人血液中CART一個(gè)月后,有細(xì)胞免疫原性的個(gè)體和無(wú)細(xì)胞免疫原性的個(gè)體分組,體液循環(huán)中CART的數(shù)量沒(méi)有顯著差異。FCM63 CART人血液中CART一個(gè)月后,有細(xì)胞免疫原性的個(gè)體和無(wú)細(xì)胞免疫原性的個(gè)體分組,體液循環(huán)中CART的數(shù)量雖然差異不夠顯著,但是有變小的趨勢(shì),如圖6。

 

 圖片45.png 

圖6:FCM63和人源CD19抗體CART免疫原性和CART細(xì)胞存續(xù)的相關(guān)性

 

同種異體CART(通用型CART) 是CART藥物降低成本,提高患者可及性,滿足未被充分滿足臨床需求的關(guān)鍵,改造后的同種異體CART是否具有能夠達(dá)到預(yù)期的效果,使用健康個(gè)體的PBMC作為免疫細(xì)胞,輻照后的同種異體CART 作為刺激物,使用高靈敏度的ELISPOT技術(shù)進(jìn)行評(píng)估是相對(duì)較優(yōu)的評(píng)估模式,見(jiàn)圖7。

圖片46.png 

圖7:ELISPOT技術(shù)用于通用型CART的免疫排異評(píng)估


ELISPOT試驗(yàn)用于AAV基因治療藥物的細(xì)胞免疫原性評(píng)估

2019年FDA批準(zhǔn)諾華公司研發(fā)的Zolgensma?(Onasemnogene abeparvovec,AVXS-101)在美國(guó)上市,用于治療2歲以下脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy,SMA)的兒童患者。2022年8月STAT和Endpoints News先后報(bào)道,兩名兒童在接受Zolgensma治療后死亡,原因查明,罪魁禍?zhǔn)资羌毙愿喂δ芩ソ?。急性肝功能發(fā)生的根本原因是Zolgensma的病毒載體為AAV9對(duì)肝臟均具有較強(qiáng)的親嗜性,如下圖8所示該AAV9基因藥物注射到人體后會(huì)感染人的肝細(xì)胞,其衣殼蛋白會(huì)被肝細(xì)胞水解,形成HLAI病毒多肽復(fù)合物。人體的CD8+毒性T細(xì)胞會(huì)識(shí)別HLAI病毒多肽復(fù)合物,從而攻擊人體的肝細(xì)胞,引起級(jí)聯(lián)的炎癥反應(yīng),造成患者發(fā)生急性肝功能衰竭。通過(guò)ELISPOT的技術(shù)評(píng)估病毒載體在人體是否能引起T細(xì)胞免疫反應(yīng)是臨床評(píng)估基因治療安全性重要的指標(biāo)參數(shù)。

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圖8:AAV基因治療藥物介導(dǎo)的細(xì)胞免疫原性引起的肝臟毒性機(jī)理

 

    基于AAV基因治療一次治療,長(zhǎng)期有效的特征,AAV基因治療產(chǎn)品的細(xì)胞免疫原性將是影響其安全性,同時(shí)也是影響其有效性最為核心的考察項(xiàng),如圖9所示,在一款凝血因子的AAV2基因治療藥物,其療效受限于機(jī)體逐步增強(qiáng)的針對(duì)于病毒載體的細(xì)胞免疫原性。

圖片48.png 

圖9:使用ELISPOT技術(shù)檢測(cè)因治療藥物介導(dǎo)的細(xì)胞免疫原性

 

熙寧酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(ELISPOT)技術(shù)經(jīng)驗(yàn)

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(ELISPOT)作為最為靈敏的檢測(cè)技術(shù),同時(shí)也是最容易受到干擾的檢測(cè)技術(shù),其方法的穩(wěn)定性,樣品穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)解讀是關(guān)鍵。

ELISPOT的檢測(cè)結(jié)果除了受樣品的功能活性的影響,同時(shí)受到樣品的活性的影響和個(gè)體免疫學(xué)遺傳背景的影響,在驗(yàn)證和檢測(cè)過(guò)程中需要設(shè)置嚴(yán)格的對(duì)照組,基于分組需要有完善的方法學(xué)驗(yàn)證方案和驗(yàn)證參數(shù)用于數(shù)據(jù)的解讀.如圖10

圖片49.png 

圖10. ELISPOT試驗(yàn)分組設(shè)置以及驗(yàn)證參數(shù)

 

PBMC的活性將極大的受到全血采集后的保存時(shí)間的影響,通常情況下全血采集后8小時(shí)內(nèi)進(jìn)行PBMC分離,PBMC的活性才能有效的保留,極大了限制了ELISPOT的應(yīng)用。熙寧生物自主開發(fā)的全血穩(wěn)定劑配方和全血保存/分離條件的摸索積累,可將全血保存時(shí)間延長(zhǎng)至30小時(shí)再分離PBMC,ELISPOT結(jié)果無(wú)顯著的變化,同時(shí)在48小時(shí)進(jìn)行分離PBMC,ELISPOT結(jié)果能夠大部分保留,如圖11。

 

圖片50.png 

圖11.熙寧生物基于全血穩(wěn)定劑分離PBMC的全血穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

 

相比文獻(xiàn)記載,不經(jīng)過(guò)全血穩(wěn)定劑處理的全血在放置24小時(shí)和48小時(shí)后,得到的斑點(diǎn)數(shù)目有80%以上的丟失如圖12,極大了延長(zhǎng)了全血運(yùn)輸穩(wěn)定性,增加了ELISPOT樣品分析的可及性。

圖片51.png 

圖12.未經(jīng)全血穩(wěn)定劑分離PBMC的全血穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

 

熙寧生物提供臨床前和臨床階段細(xì)胞治療、基因治療和疫苗類藥物研發(fā)的細(xì)胞免疫原性檢測(cè)服務(wù),歡迎咨詢。

 

 

參考資料:

1. CDE 新型冠狀病毒預(yù)防用mRNA疫苗藥學(xué)研究

2. Fcz A ,  Xhg B ,  Yhl C , et al. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial[J].  2020.

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4. Wagner DL, Fritsche E,etc. Immunogenicity of CAR T cells in cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2021 Jun;18(6):379-393.

5. Brudno JN, Lam N,etc. Safety and feasibility of anti-CD19 CAR T cells with fully human binding domains in patients with B-cell lymphoma. Nat Med. 2020 Feb;26(2):270-280.

6. Colella P, Ronzitti G, Mingozzi F. Emerging Issues in AAV-Mediated In Vivo Gene Therapy. Mol Ther Methods Clin Dev. 2017 Dec 1;8:87-104.

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8. Validation of Cell-Based Assays in the GLP Setting-VALIDATION OF THE IFN-γ ELISPOT ASSAY.


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