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作為治療胃癌、食管癌和胰腺癌等消化道腫瘤的明星靶點(diǎn),CLDN18.2(claudin18.2)吸引了眾多制藥企業(yè)競相布局,成為繼PD1/PD-L1之后另一個(gè)抗腫瘤生物藥開發(fā)的風(fēng)口。這里,我們通過總結(jié)CLDN18.2的蛋白結(jié)構(gòu),組織表達(dá)及藥物臨床相關(guān)信息,尤其是免疫組化檢測的cutoff值設(shè)定,希望能為廣大同行帶來一些啟發(fā)和幫助。
CLDN18基因與蛋白表達(dá)
CLDN18 是CLDN家族的成員,在細(xì)胞間緊密連接中起主要作用,編碼基因長達(dá)35Kb,位于3號(hào)染色體3q21-23區(qū)域。該基因以可變剪接的形式轉(zhuǎn)錄出兩種mRNA,進(jìn)而翻譯出兩種蛋白(圖1)。CLDN18.1 和CLDN18.2高度同源,氨基酸序列相似度約為92%,其差異僅存在N端第一個(gè)外顯子,CLDN18.1使用的是1a外顯子,CLDN18.2用的是1b外顯子1。然而,可用于藥物開發(fā)和診斷檢測的第一胞外環(huán)(ECL1)的55個(gè)氨基酸中僅存在8處差異2,相似度非常高。同時(shí),CLDN18.2作為膜蛋白,胞外區(qū)較短,這新藥開發(fā)和診斷抗體開發(fā)工作帶來了較大的挑戰(zhàn)。
圖1 CLDN18.1(上)與CLDN18.2(下)的可變剪切
CLDN18蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)高度的組織特異性。正常組織中,Claudin18.1僅表達(dá)于肺部,CLDN18.2僅在胃粘膜已分化的上皮細(xì)胞表達(dá),其他組織均無表達(dá)2(圖2);該特征為CLDN18.2成為潛在的抗腫瘤靶點(diǎn)奠定了非常好的基礎(chǔ),有助于降低藥物的非腫瘤靶向的毒性(on-target off-tumor toxicities)。
圖2 Claudin18.1(CLDN18.1)與CLDN18.2(CLDN18.2)在正常組織中的分布(mRNA水平)
總之,在正常生理狀態(tài)下CLDN18.2僅在埋藏于胃粘膜上已分化的上皮細(xì)胞中表達(dá),正常組織中的單抗基本上接觸不到。然而,當(dāng)惡性腫瘤發(fā)生后,原本的緊密連接破壞,使腫瘤細(xì)胞表面的CLDN18.2表位暴露出來。當(dāng)組織癌變后, CLDN18.1的表達(dá)未見明顯變化,CLDN18.2則出現(xiàn)異常激活,高度選擇性表達(dá)于胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌等。據(jù)文獻(xiàn)披露,CLDN18.2表達(dá)發(fā)現(xiàn)于38%~87%胃癌3,4,5,6,7、20%~59%胰腺癌5、18%食管癌8和3%非小細(xì)胞肺癌9。對(duì)于晚期轉(zhuǎn)移性胃癌,HER2陽性率不足20%4。相對(duì)廣泛的腫瘤特異性膜表達(dá),使之成為較為理想的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)和潛在的伴隨診斷開發(fā)生物標(biāo)志物。當(dāng)然,藥物開發(fā)過程中為了降低毒副作用,有效規(guī)避與CLDN18.1的交叉反應(yīng)也是必不可少的。對(duì)于診斷抗體而言,特異性結(jié)合 CLDN18.2而不與CLDN18.1結(jié)合是精準(zhǔn)地指導(dǎo)患者篩選的基本要求。
CLDN18.2藥物臨床進(jìn)展及診斷cutoff值
目前,全球約有60款在研CLDN18.2藥物,除單克隆抗體外,嵌合抗原受體T細(xì)胞治療(CAR-T)、雙特異性抗體,抗體偶聯(lián)藥物(ADC)和mRNA療法等也成為CLDN18.2新的治療方向。
單克隆抗體相關(guān)藥物
單抗領(lǐng)域是CLDN18.2藥物進(jìn)展最快的領(lǐng)域。相關(guān)免疫組化檢測的信息也是最多。進(jìn)展最快的是安斯泰來的Zolbetuximab。在該藥的臨床中,影響比較大的主要是Mono研究和FAST研究。研究人員為確定目標(biāo)人群的CLDN18.2表達(dá)的cutoff值,進(jìn)行了不懈探索,可以為后來者提供一定的參考。
Mono研究
在Mono研究(NCT01197885)中,經(jīng)過篩選,從268名患者中選擇了54 位≥50% 腫瘤細(xì)胞中等或強(qiáng)表達(dá)CLDN18.2的患者入組。結(jié)果顯示,總體客觀緩解率(ORR)為 9%,達(dá)到SD(Stable disease) 的患者為 14%。然而,在≥70% 腫瘤細(xì)胞中等或強(qiáng)表達(dá) CLDN18.2 的患者中,ORR值更高, 為14%,SD的比例也上升到17%。由此可見,CLDN18.2單抗對(duì)于CLDN18.2高表達(dá)人群顯示更好的療效(圖3)10。該試驗(yàn)中使用的IHC抗體是來自Zymed的抗CLDN18.2的兔多抗,結(jié)果的可重復(fù)性較差。同時(shí),鑒于該研究只是一個(gè)單臂試驗(yàn),入組人數(shù)也有限,且ORR值并不高,后續(xù)需要更多的臨床研究和改進(jìn)。不可否認(rèn)的是Mono研究初步確定了Zolbetuximab后續(xù)臨床試驗(yàn)的cutoff值為70%。
圖3 Mono研究中腫瘤體積變化。A:CLDN18.2染色細(xì)胞比例<70%,B:CLDN18.2染色細(xì)胞比例≥70%
FAST研究
2021年2月,Ann Oncol發(fā)表Ⅱb期臨床試驗(yàn)FAST研究(NCT01630083)的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù),為外界披露了單克隆抗體Zolbetuximab進(jìn)一步的數(shù)據(jù)。考慮到MONO研究單藥治療相對(duì)較低的反應(yīng)率,F(xiàn)AST研究采用了Zolbetuximab聯(lián)合化療(EOX)的治療方案。同時(shí),為了進(jìn)一步驗(yàn)證,CLDN18.2 的cutoff值,選擇了≥40% 腫瘤細(xì)胞中等或強(qiáng)表達(dá) CLDN18.2為入組條件。檢測方法使用的是CLAUDETECT?18.2 immunohistochemistry assay [Ganymed, Germany],克隆號(hào)為43-14A。該抗體實(shí)質(zhì)上是一個(gè)既能識(shí)別CLDN18.1也能識(shí)別CLDN18.2的抗體,特異性較低。結(jié)果顯示,Zolbetuximab 聯(lián)合化療相對(duì)與單獨(dú)化療顯著改善了mPFS(7.5 vs 5.3 個(gè)月)和mOS(13.0 vs 8.3個(gè)月)。在探索性分析的過程中,高表達(dá)組,即≥70%腫瘤細(xì)胞CLDN18.2陽性患者的mPFS長達(dá)9個(gè)月,mOS更是達(dá)到了16.5個(gè)月,甚至優(yōu)于曲妥珠聯(lián)合化療的13.8個(gè)月的mOS,而40-69%腫瘤細(xì)胞CLDN18.2陽性患者的mPFS和mOS在Zolbetuximab 聯(lián)合化療的情況下與單獨(dú)化療沒有顯著性差異(圖4)。該結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了70%的cutoff值6。
圖4 FAST研究中PFS和OS變化
總體PFS和OS(A,D),≥70%腫瘤細(xì)胞CLDN18.2陽性PFS和OS(B,E)和40-69%腫瘤細(xì)胞CLDN18.2陽性PFS和OS(C,F)
SPOTLIGHT研究和GLOW研究
基于前期研究,基本明確了以70%腫瘤染色比例作為cutoff值。然而,在III期試驗(yàn)SPOTLIGHT(NCT03504397)和GLOW(NCT03653507)中,研究人員將Cutoff值改成了75%(檢測抗體克隆號(hào)仍為43-14A)。主要是因?yàn)镮HC方法從原來的手工方法改為Ventana自動(dòng)化平臺(tái)方法。據(jù)文獻(xiàn)提示,自動(dòng)化平臺(tái)中75%腫瘤細(xì)胞陽性等效于原手工方法的70%陽性11。自動(dòng)化平臺(tái)方法的使用使得檢測過程更加穩(wěn)定,結(jié)果判讀更加可靠。至此,基本確認(rèn)了基于Ventana平臺(tái)的>75%腫瘤細(xì)胞CLDN18.2中等或強(qiáng)表達(dá)為最終的cutoff值(表1)。
研發(fā)企業(yè) | 藥物 | 臨床階段 | 種類 | 適應(yīng)癥(簡稱) | 臨床試驗(yàn)舉例 | |
NCT No. | 入組標(biāo)準(zhǔn) | |||||
安斯泰來 | Zolbetuximab IMAB362 | IIa期 | 單抗 | GC, EC | NCT01197885(MONO) | CLDN18.2+,≥50%,≥2+ |
IIb期 | 單抗 | GC | NCT01630083(FAST) | CLDN18.2+,≥40%,≥2+ | ||
Ⅲ期 | 單抗 | GC,GEC | NCT03504397(SPOTLIGHT) | CLDN18.2+,≥75%,≥2+ | ||
Ⅲ期 | 單抗 | GC,GEC | NCT03653507 (GLOW) | CLDN18.2+,≥75%,≥2+ |
表1 Zolbetuximab相關(guān)的主要臨床試驗(yàn)
除此之外,創(chuàng)勝的CLDN18.2單抗(TST001)在I期臨床試驗(yàn)(NCT04495296)中采用了≥40% 腫瘤細(xì)胞中等或強(qiáng)表達(dá) CLDN18.2為入組條件,后期可能會(huì)根據(jù)臨床試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析,確定最終的cutoff值11。
除此之外,國內(nèi)外眾多藥企也在CLDN18.2單抗的道路上奮起直追,大多采用的是CLDN18.2陽性作為入組條件進(jìn)行探索,由于公開披露的信息有限,具體的檢測策略暫不做詳述。
CAR-T相關(guān)藥物
根據(jù)PD-1藥物的經(jīng)驗(yàn),不同的藥物的伴隨診斷檢測有著不同的cutoff值。若是不同類型的藥物,cutoff值的確定也需要結(jié)合臨床試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行探索。在CLDN18.2 CAR-T領(lǐng)域,科濟(jì)公司目前是走在全球領(lǐng)先地位的。
CT041是科濟(jì)藥業(yè)開發(fā)針對(duì)CLDN18.2靶點(diǎn)的全球首款CAR-T產(chǎn)品,用于治療CLDN18.2陽性實(shí)體瘤。在Ⅰb期臨床研究中,采用的cutoff值為≥10%的腫瘤細(xì)胞claudin18.2表達(dá),染色強(qiáng)度≥1+。盡管相比于單抗藥物,該試驗(yàn)采用了比較保守的cutoff值,但CT041仍表現(xiàn)出較好的治療結(jié)果(圖5),其中針對(duì)所有患者ORR達(dá)到48.6%(95% CI, 31.9-65.6),DCR為73.0%;針對(duì)胃癌患者ORR達(dá)到57.1% (95% CI, 37.2-75.5)。在亞組分析的過程中,在不同CLDN18.2表達(dá)水平的亞組中(低表達(dá),中表達(dá)和高表達(dá)),ORR相當(dāng)(表2)。這表明對(duì)于CAR-T藥物CT041,在CLDN18.2表達(dá)不高的患者都能起到較好的治療效果,這無疑增加了潛在的獲益人群,也為后期的cutoff值確定奠定了基礎(chǔ)13。鑒于前期的良好數(shù)據(jù),目前該藥物已啟動(dòng)Ⅱ期試驗(yàn),并完成了首例患者入組,具體cutoff值信息暫未披露,估計(jì)不會(huì)有大的變化。
圖5 CT041治療后的情況變化
表2 CT041治療后胃癌不同claudin18.2表達(dá)狀態(tài)下的ORR
LB-1904是由傳奇生物開發(fā),靶向CLDN18.2的CAR-T細(xì)胞療法。目前已經(jīng)進(jìn)入臨床I期試驗(yàn),用于治療CLDN18. 2陽性的胃癌或胰腺癌。根據(jù)公開的信息,CLDN18.2陽性并未詳細(xì)定義,這里就不詳述了。除CT041和LB-1904外,國內(nèi)公司北恒生物、隆耀生物和凱地生物也布局了相關(guān)CAR-T產(chǎn)品,靶向治療實(shí)體瘤或消化道腫瘤,期待能有更好的結(jié)果出現(xiàn)。
ADC
2021年6月,石藥集團(tuán)發(fā)布公告, 經(jīng)NMPA批準(zhǔn),其ADC藥物SYSA1801獲批臨床研究(NCT05009966),在劑量爬坡階段采用的是IHC ≥ 1+,劑量擴(kuò)展階段采用的也是類似FAST研究中≥40% 腫瘤細(xì)胞IHC ≥ 2+ CLDN18.2表達(dá)為入組條件14。
康諾亞公司CMG901 為首個(gè)在中國及美國取得臨床試驗(yàn)申請(qǐng)的CLDN18.2 ADC。2021年3月,F(xiàn)DA批準(zhǔn)CMG901進(jìn)行G/GEJ癌I期臨床試驗(yàn)的申請(qǐng)(NCT04805307),該試驗(yàn)計(jì)劃入組162名已知CLDN18.2狀態(tài)的患者,評(píng)價(jià)CMG901的安全性、耐受性、藥代動(dòng)力學(xué)和抗腫瘤活性,即并不要求患者CLDN18.2是陽性,估計(jì)會(huì)在不同的亞組中對(duì)CLDN18.2的表達(dá)狀態(tài)有要求。
榮昌生物RC118 于2021年7月19日向NMPA提交RC118在國內(nèi)的臨床試驗(yàn)申請(qǐng),目前已獲批臨床。2021年11月完成澳大利亞Ⅰ期臨床研究首例患者給藥。此外,恒瑞醫(yī)藥、君實(shí)生物和科倫藥業(yè)等也布局了CLDN18.2 ADC產(chǎn)品管線。
雙特異抗體藥物
雙抗藥物方向,AMG-910進(jìn)度最快。AMG-910是安進(jìn)(Amgen)和百濟(jì)神州聯(lián)合開發(fā)的CD3/CLDN18.2雙特異性抗體,也是首個(gè)在我國申報(bào)臨床的CLDN18.2雙抗。AMG-910采用HLE-BiTE技術(shù),延長藥物半衰期,通過與腫瘤細(xì)胞CLDN18.2和T細(xì)胞CD3結(jié)合,招募T細(xì)胞定向殺傷腫瘤細(xì)胞。2020年7月1日獲得CDE的臨床試驗(yàn)受理。目前正在開展的Ⅰ期臨床研究(NCT04260191),旨在評(píng)估AMG 910治療CLDN 18.2陽性的G/GEJ腺癌患者的安全性、耐受性、藥代動(dòng)力學(xué)和療效。
繼AMG-910之后,國內(nèi)啟愈生物Q-1802(PD-L1/CLDN18.2雙抗)、天鏡生物ABL111(4-1BB/CLDN18.2雙抗)、普米斯PM1032(4-1BB/Claudin18.2雙抗)也先后獲批臨床。
總結(jié)
目前針對(duì)CLDN18.2靶點(diǎn)的生物藥層出不窮,入組cutoff值也不盡相同。安斯泰來的Zolbetuximab通過Mono研究和FAST研究基本確定了CLDN18.2陽性腫瘤細(xì)胞占比≥75%,染色強(qiáng)度≥2+為cutoff值。后續(xù)的研發(fā)企業(yè)都還在cutoff值探索階段。如科濟(jì)的CT041采用claudin18.2陽性腫瘤細(xì)胞占比≥10%,染色強(qiáng)度≥+為入組條件;石藥集團(tuán)的SYSA1801在劑量爬坡階段采用的是IHC ≥ +,劑量擴(kuò)展階段采用≥40% 腫瘤細(xì)胞CLDN18.2表達(dá)≥ 2+為入組條件;其他廠家在探索的時(shí)候大多采用CLDN18.2陽性入組;個(gè)別廠家采用CLDN18.2陰陽性均可入組??紤]不同的藥物作用機(jī)制和有效性不同,cutoff值可能不同。同類產(chǎn)品的cutoff值設(shè)定雖然有一定的參考性,但是免疫組化檢測的cutoff值影響因素較多,如藥物類型,藥效,診斷抗體特異性以及檢測平臺(tái)的穩(wěn)定性等都是重要的影響因素,重要的是結(jié)合具體產(chǎn)品的作用機(jī)制和實(shí)際的有效性結(jié)果選擇適合的檢測。
為此,參考公開的文章及主要臨床試驗(yàn),基于當(dāng)前最穩(wěn)定的Ventana免疫組化自動(dòng)染色平臺(tái),熙寧生物建立了CLDN18.2免疫組化的檢測方法(圖6),可為廣大客戶提供穩(wěn)定高效的臨床試驗(yàn)階段樣本檢測服務(wù),歡迎垂詢。
圖片待補(bǔ)充
圖6 免疫組化法檢測腫瘤中CLDN18.2表達(dá)結(jié)果示例
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14. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT05009966
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